解凍作為細胞培養的第一步，本篇文章說明細胞解凍的步驟、注意事項，以及常見的冷凍保護劑，如DMSO及glycerol的保護原理。
解凍步驟
- 在37°C水浴槽回溫新的medium。
- 以70% ethanol擦拭瓶身後，移入BSC內。
- 從液態氮或乾冰中取出凍管(cryotube vial)。
- 取出凍管，並立即放入37°C水浴槽中快速解凍。
- 輕輕搖晃凍管，使凍存液在1~2分鐘幾乎融化。
- 以70% ethanol擦拭凍管，移入BSC內。
- 於BSC內，依細胞種類及濃度，取適量medium加至培養瓶中。緩慢加入已解凍的細胞懸浮液。
- 混合均勻 (pipetting→順時針轉→逆時針轉→8字轉)。
- 放入培養箱培養。
- 計數細胞。
若要立即去除冷凍保護劑(例如DMSO或glycerol)，則須多一個離心的步驟，將冷凍保護劑去除，才能進行培養。如以下步驟：
- 將解凍的細胞懸浮液加入含有5~10ml medium的離心管內。
- 離心(通常為1000 rpm、5分鐘)。
- 移去上清液。
- 加入新medium，混合均勻 (pipetting→順時針轉→逆時針轉→8字轉)。
- 將細胞液轉移至培養瓶內。
- 放入培養箱培養。
細胞解凍注意事項
- 預熱medium可避免溫差對細胞的衝擊。
- 解凍速度需速度快，因為慢速解凍會導致冰晶形成，傷害細胞膜。
- 解凍過程中要全程無菌，避免污染。
冷凍保護劑DMSO及glycerol的相關問題
解凍後初期細胞為什麼會比較脆弱？
因為解凍的過程會導致細胞內外的冰晶融化及重組，會損害細胞膜，使細胞在解凍初期變得脆弱，需要時間恢復。但大多細胞在凍存時會加上冷凍保護劑，冷凍保護劑能防止在冷凍過程中形成冰晶，保護細胞膜不被破壞。
Dimethyl sulfoxide (DMSO)為什麼可以作為冷凍保護劑？
DMSO的作為冷凍保護劑的方式是“防止冰晶形成”。因為細胞在冷凍過程中，水分會結晶形成冰晶，刺破細胞膜，造成細胞死亡。
而DMSO的作用原理為，DMSO能快速穿透細胞膜，進入細胞內部，與水分子形成氫鍵，降低水的冰點，避免細胞在低溫下形成冰晶，以降低細胞的冷凍傷害。
為什麼細胞解凍時要去除DMSO？
雖然DMSO能保護細胞在冷凍時存活，但在37°C的環境中具有細胞毒性，會損害細胞膜、影響細胞功能。
Glycerol(甘油)為什麼可以作為冷凍保護劑？
Glycerol作為冷凍保護劑的原理與DMSO相同，都是防止冰晶形成。Glycerol能與水分子形成氫鍵，減少在冷凍過程中冰晶的生成。
Glycerol是較溫和的保護劑，因為Glycerol的細胞毒性 遠低於DMSO。但Glycerol滲透細胞膜速度較慢，所以須依照細胞類型與使用條件不同來決定使用哪一種冷凍保護劑。
